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四、 实验步骤
1、 无菌操作解剖小白鼠，从小白鼠脾脏或肝脏作细菌分离培养于普通平板、血平板和肉汤培养基中。
2、 取脾、肝或血液在载玻片上作触片或涂片。
3、 用炭疽杆菌纯培养物和枯草杆菌纯培养物在另一块载玻片上作涂片。
4、 待步骤2、3中的触片和涂片自然干燥，火焰固定，在5…10％甲醛溶液中浸泡10…15分钟，灭活细菌，置玻片架上晾干。
5、 组织触片用美兰染色，纯培养物用革兰氏染色，镜检，观察细菌形态。
6、 Ascolis反应
取脾脏、肝脏数克剪成小块，置消毒试管中，加3…5倍量生理盐水，隔水煮沸30分钟，2000转/分离心15分钟，吸取脂肪层下的溶液与炭疽沉淀血清作Ascolis反应。
示教实验 串珠试管
五、 思考题
1、 炭疽杆菌的形态特征和培养特征主要有哪些？与枯草杆菌有什么区别？
2、 Ascolis反应的原理是什么？它在炭疽诊断中是否可靠？为什么？
3、 炭疽杆菌在什么情况下能形成串珠现象？
4、 肉联厂发生了疑似炭疽，应如何尽快进行诊断和处理？
实验二 巴氏杆菌病的诊断
一、 目的
观察鸡巴氏杆菌病的临床表现和病理变化；
掌握巴氏杆菌病的实验室诊断方法。
二、 实验器材
美兰染色液 瑞氏染色液
载玻片 染色缸 吸水纸 显微镜 镜油 擦镜纸
试管架 铂金耳 酒精灯 镊子 剪刀 生理盐水
肉汤培养基 血平板 酒精棉球 0。1％新洁尔灭消毒液
送检鸡
三、 实验动物的准备
１、 移植鸡巴氏杆菌强毒株于一支血斜面和一支肉汤培养基上，３７℃培养２４小时。
２、 用生理盐水洗下血斜面上的巴氏杆菌菌落，制成菌悬液，取２０ｍｌ注射于小白鼠腹腔，小白鼠在２４－４８小时内死亡。
３、 无菌操作解剖死鼠，去死鼠肝脏触片，染色，镜检，若确为巴氏杆菌致死，则取出肝脾于玻璃磨碎器中，加入５－１０倍量的肉汤培养基或生理盐水，磨碎，制成组织悬液，取该悬液0。3…0。4ml注射健康鸡；肌注，通常鸡在注射后24小时死亡，死鸡供实验用。
四、 实验步骤
１、 解剖鸡。无菌操作，自肝脏作细菌分离于血琼脂平板，37℃培养16…24小时，观察培养结果。
２、 取肝、心血制触片或涂片数张，美兰和瑞氏染色，镜检，观察细菌形态。
３、 仔细观察死亡鸡病变（肌肉、皮下、肝、心包、心冠脂肪、肺、浆膜、粘膜等脏器组织病变），并做记录。
４、 示教组织中的巴氏杆菌。
五、 思考题
１、 巴氏杆菌的菌落和培养特性是什么？
２、 为什么巴氏杆菌成两极染色？
３、 什么是巴氏杆菌的荧光现象？与致病菌性有无关系？
４、 巴氏杆菌能致多种动物的疾病；其主要特点是什麽？
５、 从病猪脏器分离到巴氏杆菌；；是否就可以确诊为巴士杆菌病？为什么？
６、 研制巴士杆菌疫苗要注意什么问题？
实验三 结核杆菌病和布氏杆菌病的检疫
一， 目的
掌握结核杆菌病的变态反应诊断方法；
掌握布氏杆菌病的血清学诊断方法。。
二；实验器材
消毒盒 剪毛剪 镊子 游标卡尺 纱布 变态反应用金属注射器和针头 结核菌素 记录表 酒精棉球 搪瓷盘 兽用16号针头贴有标签的无菌5ml试管 胶鞋
试管架 干净试管 干净吸管（1ml或5ml）100ml三角烧瓶 0。05％石炭酸生理盐水 布氏杆菌阳性诊断血清 布氏杆菌试管凝集试验用抗原 被检牛血清 振荡器 布氏杆菌阴性诊断血清
三；实验步骤
（一） 第一次实验（地址：牛场）
内容：变态反应皮内试验和采血
1；将牛固定好。
2；在成牛颈侧中部上1/3处剪毛；直径为10cm
3；用游标卡尺测量术部中央皮皱厚度并作好记录
4；术部用酒精棉球消毒
5；向术部中央注射0。2ml结核菌素；注射时应同时向前和向皮肤内用力；将针头斜向刺进皮内；并应立即用左手固定针头；或手慢慢将结核菌素注射进皮内。抽出针头后；用手指检查注射部位是否有突起的硬块；若无硬块必须重新注射。
6；寻找颈静脉。
7；在颈静脉处剪毛，术部用酒精棉球消毒。
8；左手按住颈静脉的术部向心端；右手将16号针头垂直或沿颈静脉走向斜向刺入颈静脉；调整针头插入深度使静脉血从针头流出；立即用消毒试管收集流出的血液，在采血的过程中，左手始终要按紧颈静脉的术部向心端；扎针时要看清突起的血管，果断用力，力求一针见血。
9；每头牛采3…5ml血液，送开左手后；右手拔出针头；用酒精棉球消毒术部，在收集血液的试管上标记上相应的牛号。将采有血液的试管斜放，待凝固后，带回实验室分离血清，以便进行布氏杆菌凝集实验。
结核菌素点眼试验（操作示范）
（1） 保定牛。
（2） 仔细检查牛眼睛，发炎者不能做点眼试验。
（3） 用左手拇指和食指将牛眼的上、下眼睑分别向上、下翻张使眼结膜囊暴露，右手用1％硼酸棉球擦去眼周围活物。
（4） 右手用滴管将结核菌素…5滴滴入眼结膜内，滴管头不要接触眼结膜。
（二） 第二次实验（地址：牛场）
1 ，变态反应皮内实验。必须在第一次注射结核菌素后，分别在７２小时和第１２０小时观察注射局部的反应情况。主要是观察有无炎症反应；并测量皮皱厚度和肿胀面积的大小，据此判定试验结果，对第72小时观察，反应呈阴性或可疑的牛只须立即在第一次注射的同一部位，以同一剂量进行第二次注射，剂量同第一次。第二次注射后48小时（即第一次注射后第120小时）应在观察一次。观察情况均有详细记录。
变态反应点眼实验 应于点眼后3；6；9小时各观察一次；并作好记录，必要时可观察第24小时的反应；观察时可作翻眼检查
（三）分离血清步骤
１、 将试管中凝固的的血清检样，2000转/分离心15分钟。
２、 将血凝块上的血清用滴管吸至另一空的消毒试管中，然后将原试管上的牛号标签贴至血清的试管上。
３、 如果离心后仍无血清析出，可用干净铁丝插入管底，沿管壁移动铁丝使血凝块与试管分离，再离心，并重得步骤2。
４、 血清置4℃冰箱保存，72小时内作布氏杆菌试管凝集试验。
（四）布氏杆菌试管凝集试验
１、 操作方法表解如下：
试管号 1 2 3 4 5 6 7
稀释倍数 1：25 1：50 1：100 1：200 1：400 阳性对照 阴性对照
试
液
0。5％石炭酸生理盐水 2。4
0。1
0。5 0。5
0。5 0。5
0。5 0。5
0。5 布氏杆菌阳性诊断血清（1：100）
0。5ml
弃0。5ml 布氏杆菌阴性诊断血清（1：100）。
0。5ml
布氏杆菌诊断Ag（1：20） 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5
充分振荡；混匀；37℃温箱24小时；观察结果
２、 比浊管制备
3。5％石炭酸生理盐水
布氏杆菌诊断Ag液（1：10）
清朗度
标记
1。0
0。75
0。5
0。25
0。0
0。6
0。25
0。5
0。75
1。0 100％
75％
50％
25&
0。0％ ＋＋＋＋
＋＋＋
＋＋
＋
…
３、 判定结果并记录
四、思考题
１、 本试验中，如何观察结果？确定为结核杆菌或布氏杆菌病阳性、可疑的标准各是什么？对阳性或可疑牛应如何处理？
２、 犊牛变态反应皮内法的试验部位是什么？注射剂量是多少？羊布氏杆菌凝集试验用什么稀释度？
３、 家畜布氏杆菌的诊断方法有哪几种？其优点各是什么？
４、 在进行牛结核病菌 变态反应诊断时，什么情况下春用皮内法？在什么情况下需同时用皮内和点眼两种方法？为什么？
实验四 猪瘟的诊断
I免疫酶组化法
一、 目的
了解免疫酶组化法的一般程序和酶标记技术：
掌握用免疫酶组化法诊断猪瘟的方法。
实验器材
剪子、镊子、100ml染色缸。载玻片、玻片ml试管、滴头、1ml吸管、脱脂棉、吸水纸、擦镜纸、显微镜、橡皮膏、酒精灯、铂耳、1000ml烧杯、铜蓝、搅拌器、磁捧、酒精棉球
500ml量筒、500ml三角烧瓶、大滤斗。
酶标抗体、PH7。2 0。015M PBS、1％NaN2、1％H2O2、Tris_HCL缓冲液、DAB 、4℃丙酮、病猪血液（抗菌素凝血）、病猪脏器、水浴箱。
二、 溶液配制
１、 PH7。6 0。05Mtris_HCL缓冲液：
0。2M Tris（24。24g/l） 250ml
0。1N HCL（8。4ml/L） 375ml
NaCL 7。6g
DW 1000ml
2、0。01％H2O2、NaN2、PH7。6 0。05M Tis…HCL；缓冲液；用作内源酶灭活液：
取PH7。6 0。05M Tris…HCL缓冲液98ml；加1％H2O2 1ml和1％NaN2 ；1ml即成。
3底物液：PH7。6 0。05M Tris…HCL缓冲液100ml加DAB75mg；避光搅拌3小时；使其溶解；滤纸过滤。临用前加工厂％H2O2 0；5ml。
四、 实验动物的准备
用猪瘟自然病例或人工感染猪病料作实验。
人工感染需要在实验前四天用猪瘟强毒（血毒）注射40斤左右的猪瘟易感猪，2ml/只，肌注。猪在3…4天后发病死亡，临死前采猪心脏血，抗凝，以备做白细胞涂片。
解剖猪，采淋巴结、脾、扁桃体，各做组织触片。
五、 实验田步骤
１、 制片
（1） 取试管中抗凝血浆层置另一空试管中3000r/ml15分钟，弃血浆，用生理盐水将试管中的沉积细胞洗一次，最后用0。1…0。3ml生理盐水悬浮沉积细胞；取2铂耳在载玻片上作2个均匀的涂片。自然干燥。
（2） 用脾、肾、淋巴结、扁桃体等脏器中的一种在载片上作两个横切触面，自然干燥。
（3） 对两�