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第九章 临床常见病原体检测
表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。与浮游菌相比，生物膜中细菌对抗生索
的耐药性可提高lo～1000倍，其耐药性主要取决于其多细胞结构：①生物膜中的胞外多
糖起屏障作用，限制抗生素分子向细菌运输。②生物膜中微环境的不同可影响抗生素的活
性。③诱导细菌产生特异性表型。④多菌种的协同作用。具有生物膜的细菌多见于铜绿假
单胞菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、变异链球菌。
细菌的多种耐药机制可协同作用，导致多耐药菌株的出现。
二、检查项目、结果和临床应用
常用的检查细菌是否对药物耐药的方法有定性测定的纸片扩散法、定量测定的稀释法
和E试验法。对某些特定耐药菌株的检测除药物敏感试验外还要附加特殊的酶检测试验、
基因检测等方法。
（一）药物敏感试验
1．K—B纸片琼脂扩散法（Kirby—Bauer disc agar diffusion method） 世界卫生组织
推荐的标准纸片扩散法，是由Kirby和Bauer建立的。将含有定量抗菌药物的纸片贴
在接种有测试菌的M—H琼脂平板上置3 5℃孵育16～18h。用游标卡尺量取纸片周
围透明抑菌圈的直径，参照CLSI（Clinical and Laboratory Standard Institute）标准判读
结果，按敏感（susceptible，S）、中度敏感（intermediate，I）、耐药（resistant，R）
报告。S：测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭；
I：测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制，或在测定药物
浓集部位的体液（如尿）中被抑制；R：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗
菌药物浓度所抑制。
2．稀释法稀释法所测得的某些抗菌药物抑制检测菌肉眼可见生长的最低浓度称为
最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），有肉汤稀释法和琼脂稀释法两
类，前者为临床实验室常用的一种定量试验。先以水解酪蛋白液体培养基将抗生素作不同
浓度稀释，再种入待检菌，置35℃孵育24h后，以不出现肉眼可见细菌生长的最低药物浓
度为该菌的MIC，参照CLSI标准判读，结果按敏感和耐药报告。
3．E试验 是结合稀释法和扩散法原理和特点而设计的一种操作简便（如同扩散法）、
精确测定MIC（如同稀释法）的一种方法。在涂布有待测试菌的平板上放置1条内含干
化、稳定、浓度由高到低呈指数梯度分布的商品化抗菌药物塑料试条。35℃孵育16～18h
后抑菌圈和试条横向相交处的读数刻度即是待测菌的MIC，参照CI。SI标准判断耐药或敏
感。由于药物塑料试条价格较贵，目前尚未在临床广泛使用。
4．耐药筛选试验耐药筛选试验是以单一药物、单一浓度检测细菌的耐药性，临床
常用于对耐甲氧西林葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌，对庆大霉素或链霉素高水平耐药的肠
球菌。
5．折点敏感试验 折点敏感试验是仅用特定抗生素浓度（敏感、中介或耐药折点
MIC）而不使用测定MIC时所用系列抗生素浓度测试细菌对药物的敏感性。当选择区分
中介和耐药折点值药物浓度时，若两种抗药物浓度培养基均生长，可判断为耐药；如在
2种药物浓度均不生长则为敏感；仅在较低药物浓度培养基中生长提示为中介。
（二）耐药菌监测试验
1．耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的筛选测定 包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
（MRsA）和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRSCoN），是目前导致医院感染的重要病
原菌。此类葡萄球菌具有多重耐药性，即对全部0一内酰胺类抗菌药物，包括青霉素族和
头孢菌素族以及临床常用的其他多种抗菌药物均耐药。因此，此类葡萄球菌的早期检出和
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确定具有重要临床意义。检出方法可用添加有4％Na（：1和6sag苯唑西林／ml培养基的M—
H琼脂进行筛选测定。测试菌的准备和接种方法同纸片扩散法药敏试验，用1“l接种环接
种或棉拭点种，接种菌量为10。CFu／点。35℃孵育24h，有菌落生长者即为MRS。同时
以标准菌株金葡菌ATCC29213、金葡菌ATcC38591以及已知为阳性的MRS菌株作质控
菌株。
2．氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定 对多种抗菌药物包括氨基糖苷类呈
固有耐药是肠球菌的特点，故单用氨基糖苷类治疗肠球菌感染无效。但如与一种作用于细
胞壁的抗菌药物如青霉素类合用，则可发生协同作用而增强杀菌效力。如果肠球菌对氨基
糖苷类产生了高耐药性，这种联合应用就会无效。所以及时筛选出肠球菌中氨基糖苷类高
耐药株，有助于临床调整和重新确定治疗方案。其检测可采用纸片扩散法和肉汤稀释法。
当对庆大霉素纸片（120／xg／m1）的抑菌圈直径≤6mm时可判为耐药；当抑菌圈直径在7～
9mm时，I可进一步采用肉汤稀释法或E试验测定MIc以确定是否为耐药。以
ATC（229212和ATCC51299为质控菌株。
3．耐青霉素肺炎链球菌（PRSF’）的筛选测定 为早期及时筛选出此类肺炎链球菌可
采用1pg苯唑西林纸片筛选法。测试方法同纸片琼脂扩散法，培养基用含5％羊血的M—
H琼脂。如抑菌圈≥20ram，则测试菌对青霉素G敏感，如抑菌圈≤19mm，则提示该菌
可能对青霉素耐药或中度敏感，需用稀释法或E试验进一步做青霉素G的MIc测定。质
控菌株采用肺炎链球菌ATcc49619。
4．p一内酰胺酶检测 p一内酰胺酶能裂解青霉素族和头孢菌素族抗生素的基本结构口一
内酰胺环，从而使其丧失抗菌活性。应用快速的B一内酰胺酶检测法可比常规药敏提前24～
48h获得结果以协助临床合理用药。常用的检测方法有产色头孢菌素法和碘～淀粉测定法，又
以前者为临床实验室最常用，只需将产色头孢菌素（Nitrocefin）商品化纸片用无菌蒸馏
水湿润，点种菌落，若测试菌产生p一内酰胺酶，产色头孢菌素的p一内酰胺环被打开，点
种的菌落将在30min内变红色。
5．超广谱p一内酰胺酶（ESBI一）检测 ESBI。的水解底物除一、二代头孢菌素外，对
第三代头孢菌素（如头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松等）以及氨曲南均有作用，它的检测
可用微生物学、生物化学和分子生物学方法进行。后两者目前仅用于实验室研究，临床上
广泛应用微生物学法，包括双纸片扩散法、三相试验和E试验等，其中双纸片协同试验操
作简便、结果可靠、成本不高，是临床上较常开展的项目。将待测菌液适量均匀涂布M—
H平板，贴上阿莫西林／克拉维酸纸片和三代头孢菌素纸片（纸片相距30mm），35℃孵育
16～18h后观察结果，若三代头孢菌素纸片在朝向阿莫西林／克拉维酸纸片方向有抑菌圈
扩大现象即为阳性结果，提示该菌产ESBI_，。
（三）病原体耐药基因的测定
细菌耐药基因的检测正由研究实验室走向临床实验室。采用分子生物学方法检测病原
菌耐药基因的临床意义在于：①可比培养法更早检测出病原菌的耐药性，尤其适用于检测
生长缓慢病原菌（如结核分枝杆菌），有利于临床早期合理选药治疗。②耐药基因的检出
对病原菌的耐药性具有确诊意义，特别是当病原菌对某一抗菌药物的耐药表型呈现“敏
感”或边缘耐药时，如mec…A基因的检出可确证对苯唑西林表现为边缘耐药的MRSA。
③在细菌耐药性及其扩散的流行病学监测中，耐药基因的检测比常规方法检测病原菌的耐
药谱更准确。④耐药基因的检测可作为考核其他耐药性检测方法的金标准。
细菌耐药性基因检测方法有，PcR法、PCR—RFI。P分析、PCR—SS（：P分析、生物芯
片技术和自动测序技术。目前已有检测肠球菌的链霉素耐药基因、万古霉素耐药基因和对
庆大霉素高耐药基因、葡萄球菌的苯唑西林耐药基因、肺炎链球菌的G一内酰胺类抗生素
。。，参，；弘§0；
第九章 临床常见病原体检测
耐药基因、革兰阴性杆菌的B一内酰胺类抗生素耐药基因，以及检测结核分枝杆菌对利福
平等抗结核药物耐药性的商品化耐药基因检测试剂盒，相信随着方法的不断完善及标准
化，病原菌耐药基因的直接检测将是未来病原菌耐药性检测的主导方法。
第三节 临床感染常见病原体检测
感染性疾病（infectious diseases）指各种生物性病原体（病原微生物、寄生虫）寄生
人体所引起的传染性感染疾病（communicable infectious diseases）和非传染性感染疾病
（non—communicable infectious diseases）。随着现代医学技术的迅猛发展，新的医学诊疗技
术的广泛应用，大量老年人群及慢性疾病患者的存在，抗菌素／抗生素滥用所导致的细菌
变异耐药株的增多，使当今感染性疾病的特点已经发生了一定的变化。因此，了解现代感
染性疾病的流行病学，对于完善感染性疾病的实验室诊断，指导临床合理应用抗病原体药
物，及时控制感染性疾病的流行具有重要意义。
一、流行病学和临床类型
（一）流行病学
目前，感染性疾病的流行病学具有下述特点：①疾病谱发生变迁，新传染病陆续被发
现，近20年来在全球范围内先后发现了30多种新传染病，如嗜肺军团菌（Ligionella
pnetlmohp．1lia）引起的军团病（Legi c）nnaires disease）、汉坦病毒 （Hantavirus，HV；
Hanntaan Virus） 引起的汉坦病毒肺综合征 （Hantavirus pulrnorlary syndrome，HPS）、埃
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